2022年11月29日，老葡萄京官网 - (中国)有限责任公司朱书生教授团队在微生物著名期刊Microbiology

Spectrum（IF=9.043）发表了题为“Foliar

Pathogen Infection Manipulates Soil Health through Root Exudate-Modified

Rhizosphere Microbiome”的研究论文。该论文揭示了植物叶部经病原菌刺激后能改变根系代谢物的分泌而调控根际微生物群落，缓解根腐病的发生。文章提出了“根病叶治”的根际土壤健康调控新策略。

由土传病原菌侵染引起的根腐病是作物健康生产的重要限制因素，也是作物连作障碍的主要体现形式，是植物病害防治领域的重大难题。连作障碍是植物普遍存在的机制，生态学称为“植物—土壤的负反馈（Negative

Plant-Soil Feedback，NPSF）”。自然生态系统中植物—土壤的负反馈是维系物种多样性的一个普遍机制，但其引发的根腐病也是限制集约化农业系统中作物健康生长的重要因素。针对作物根腐病这一植物保护领域的重大难题，目前已形成包括作物轮作、土壤消毒、生防菌施用等多种防治策略，但这些措施都面临诸多限制。例如，轮作措施的周期往往较长且效果不稳定；土壤化学消毒通常会造成环境污染，并且土传病原菌通常能快速再殖；外源施用生防菌面临田间效果不稳定等问题。

植物在长期的生存过程中，进化出了多种抵御生物和非生物胁迫的策略。除了在细胞水平上涉及生理和遗传修饰的内部免疫策略，植物还可以通过募集根际有益微生物的外部策略来缓解胁迫。由于土壤环境的错综复杂，很难通过直接抑制土壤中的病原菌来防治地下土传病害。目前，国内外植物病理学家对土传病害的自然消退现象的深入研究表明，在长期土传病原菌侵染的条件下，植物可以募集土壤中具有拮抗病原菌功效的微生物群落，并形成“抑病土壤”来降低土传病害的危害。这一理论也为通过发挥植物自身内在潜能来调控根际有益微生物抵抗地下病害提供了很好的思路。朱书生教授团队近年来致力于研发新型环保高效的植物根腐病防治策略，构建了一种调控植物代谢和分泌来募集有益微生物缓解自身根腐病的新模式。

本文以根腐病发生非常严重的五加科人参属三七为模式植物，深入研究（1）链格孢菌（Alternaria

panax）侵染三七叶部能否缓解根腐病；（2）链孢菌侵染对根际微生物组结构和功能的影响及其在根腐病抑制中的作用；（3）叶片被侵染后，三七根系分泌物的变化及其对根际微生物群落结构和功能的调控作用。

研究结果表明，三七叶部被人参链孢菌（Alternaria

panax）侵染后能缓解植物—土壤负反馈，减轻根腐病的发生（图1，B）。同时，叶部被侵染后的三七根际土壤再植三七，还能提高下茬三七对叶部病原菌侵染的抗性（图1，C）。

图1试验流程图以及三七叶部病原菌侵染对植物-土壤反馈调节的影响

注：A，本实验过程用于评估叶面侵染对植物-土壤反馈和植株抗性的影响。在步骤1中，分别设置未种植处理、种植三七无叶部接种以及种植三七叶部接种病原菌3个处理。在第2步中，将上述三种处理的土壤平均分成两部分。一部分土壤在121°C下灭菌20分钟，另一部分不做处理。然后将这些土壤重新放入花盆中，种植三七种子，并记录种子出苗率。在步骤3中，计算反馈比率，每个重复对的反馈比计算为（Ai-Bi）/maximum（Ai，Bi），其中Ai和Bi表示接种或未接种处理（Ai）以及各自对照（Bi）土壤中的出苗率。另外，在未经灭菌处理的接种和未接种的土壤中，种植三七并叶部挑战接种A. panax,然后测定其病斑面积。B和C，表示反馈比率（B）和病斑面积（C）。FuBS和FsBS分别表示未灭菌或灭菌处理土壤中的反馈比率。FuIBS和FsIBS分别表示叶面侵染后未灭菌或灭菌的土壤中的反馈比率。IuBS和IuIBS分别代表叶部未侵染或侵染土壤中的病斑面积。

试验广泛收集了来自云南澜沧、寻甸、会泽、文山等多个地方的思茅松、云南松和桉树林下的21份土壤用于叶部病原菌侵染后三七根际微生物的群落结构分析。结果发现，叶片被病原菌侵染后均能显著改变根际土壤微生物的群落结构，使三七根际土壤中病原菌（如锈腐病原菌Ilyonectria

destructans）的丰度受到抑制，而木霉菌（Trichoderma）、芽孢杆菌（Bacillus）和链霉菌（Streptomycete）等有益菌群丰度显著上调。同时，这些有益的微生物不仅表现出对病原菌I.

destructans的拮抗能力，还增强了植物对叶部黑斑病菌的抗性（图2和3）。

图2叶部病原菌侵染显著改变三七根际真菌群落结构及真菌功能评价

注：A和B，未接种植物根际土壤和未种植土壤（A）或接种植物根际土壤（B）中的真菌群落的PCoA分析。C，在属水平上比较无植物（NP）、未接种（R）和接种根际（IR）土壤中的真菌丰度差异。“Suppressed”是指与未种植土壤相比，在没有叶部接种的根际土壤中，该属的丰度显著上调，但在叶部接种的根际土壤中则下调。“Enriched”是指与未种植土壤相比，在没有叶部接种的根际土壤中，该属的丰度显著降低，但在叶部接种的土壤中，其丰度升高。D，在种水平上比较无植物（NP）、未接种（R）和接种根际（IR）土壤中的真菌丰度差异。E，I.destrucans对根的体外致病性试验。F，叶部侵染后上调真菌基于ITS序列构建的系统发育树以及对锈腐病原菌（RS6、RS7、RS8和CD9）的拮抗活性测定，+++表示拮抗率≥60%。G，叶部接菌后上调真菌回接到三七根际后，叶部接种链格孢菌后的病斑面积差异。

图3叶部病原菌侵染显著改变三七根际细菌群落结构及细菌的功能评价

注：A和B，未接种植物根际土壤和未种植土壤（A）或接种植物根际土壤（B）中的细菌群落的PCoA分析。C，在属水平上比较无植物（NP）、未接种（R）和接种根际（IR）土壤中的细菌丰度差异。D，叶部侵染后上调细菌基于16S rDNA序列构建的系统发育树以及对锈腐病原菌（RS6、RS7、RS8和CD9）的拮抗活性测定，N表示拮抗率<0，+表示拮抗率为0~30%，++表示拮抗率30~60%，+++表示拮抗率≥60%。E，叶部接菌后上调细菌回接到三七根际后，叶部接种人参链格孢菌后的病斑面积差异。

本文随后使用GC-MS和HPLC-MS分析了叶部受侵染后的三七地上部和地下部代谢及根系分泌物的组成，发现叶部病原菌侵染能改变植株代谢，并增加三七根系分泌物中短链和长链有机酸、糖和氨基酸的含量（图4）。

图4叶部接种改变了三七代谢和根系分泌

注：A-C，GC-MS分析三七地上部分（A）、须根（B）和根系分泌物（C）中代谢物种类的变化；D，LC-MS分析根系分泌物中代谢物种类的变化；E,根分泌物中用于后续分析差异代谢物的热图。

关键代谢物功能验证试验表明，长链有机酸（邻苯二甲酸、棕榈酸和壬二酸）混合物，短链有机酸（戊二酸、甘油、dl-羟基丁酸、乙醇酸和丙酸）混合物，糖（核糖和d-甘露糖）混合物和氨基酸（l-天冬氨酸、丙氨酸、氧脯氨酸和l-丝氨酸）混合物分别以0.01、0.1和1.0μg/mL的浓度灌根至三七根部，均能诱导三七对链格孢菌侵染的抗性（图5A-D）。另外，使用这些代谢混合物处理三七连作土壤后重新种植三七，发现长链有机酸混合物处理组能显著增加三七存苗率。同时，浓度为0.1μg/mL的短链有机酸混合物和氨基酸混合物，浓度为0.1和1.0μg/mL的糖混合物处理组也能显著增加三七的存苗率（图5E-H）。

关键有益微生物功能验证试验结果显示，在灭菌土壤中接种叶部侵染后根际显著富集的微生物T.

atroviride、S.

coelicolor和B.

amyloliquefaciens能显著提升三七出苗率（图5I-K）。

图5叶部接种处理中上调的关键代谢物和微生物的功能评价

注：A-D，上调的关键代谢产物外源添加到根际土壤中后对三七抗黑斑病的影响。E-H，上调的关键代谢物外源添加对连作土壤中三七存苗率的影响。LCOAm代表长链有机酸（邻苯二甲酸、棕榈酸和壬二酸）混合物。SCOAm代表短链有机酸（戊二酸、甘油酸、dl - β -羟基丁酸、乙醇酸和丙酸）混合物。Sm表示糖（核糖和d -甘露糖）混合物。AAm代表氨基酸（l -天冬氨酸、丙氨酸、氧脯氨酸和l -丝氨酸）的混合物。I-K，灭菌土壤中添加叶部接种处理中上调关键微生物对三七种子萌发的影响。

微生物培养试验证明，长链有机酸混合物和短链有机酸混合物能显著抑制根腐病菌（Ilyonectria

destructans）菌丝生长，但促进有益菌T.

atroviride和B. amyloliquefaciens的生长；氨基酸混合物也能显著促进B.

amyloliquefaciens的生长；短链有机酸混合物对链霉菌的生长也具有促进作用（图6A-D）。

将长链有机酸（邻苯二甲酸、棕榈酸和壬二酸）混合物，短链有机酸（戊二酸、甘油、dl-羟基丁酸、乙醇酸和丙酸）的混合物、糖（核糖和d-甘露糖）混合物、氨基酸（l-天冬氨酸、丙氨酸、氧脯氨酸和l-丝氨酸）混合物和病原菌（I.

destructans）协同加入到灭菌的土壤中，发现这些化合物能显著抑制病原菌对三七的侵染（图6E-H）。分别将这些混合物与木霉菌协同添加到灭菌土壤中，发现能增强木霉菌对三七的促生作用（图6I-L）。另外，短链有机酸（戊二酸、甘油、dl-羟基丁酸、乙醇酸和丙酸）的混合物能协同B.

amyloliquefaciens一起促进三七的存苗（图6R）。

图6叶部侵染处理后根系分泌物中上调关键代谢产物与根腐病菌或有益菌协同处理对三七存苗的影响

注：A-D，根系分泌物中上调关键代谢物对I.

destructans(A)、T.

atroviride(B)、S.

coelicolor(C)和B.

amyloliquefaciens(D)生长的影响。B-E，叶部侵染后根系分泌物上调代谢物对三七叶部抗病性的影响。E-T，I.

destructans(I)，T. atroviride(T)，S. coelicolor(S)或B.

amyloliquefaciens(B)与长链有机酸（邻苯二甲酸，棕榈酸和壬二酸）混合物（LCOAm），短链有机酸（戊二酸，甘油酸，dl-β-羟基丁酸，乙醇酸和丙酸）混合物（SCOAm），糖（核糖和d -甘露糖）混合物（Sm）和氨基酸（l -天冬氨酸，丙氨酸，氧脯氨酸和l -丝氨酸）混合物（AAm）对三七存苗率的影响。

地下土传病害是限制可持续农业生产的主要因素，但是由于土壤环境的错综复杂，很难有效防治植物土传病害。本研究发现三七叶部受病原菌侵染后能促进根系分泌有机酸、糖和氨基酸，不仅能抑制土传病原菌还能募集根际有益微生物来缓解地下土传病害（图7）。本研究表明，通过地上部的适当刺激来调控植物根际微生物群落，实现植物土传病害的防治，是一种新的根部病害防治策略。目前，课题组正在深入解析其中的关键机制，筛选开发了一系列的“叶面处理调控根际微生物”诱导剂，为实现“根病叶治”探索新的路径。

图7叶部病原菌侵染通过根分泌物改变根际微生物组使植物-土壤反馈由负向正

注：LCOAm代表长链有机酸（邻苯二甲酸、棕榈酸和壬二酸）混合物。SCOAm代表短链有机酸（戊二酸、甘油酸、dl-β-羟基丁酸、乙醇酸和丙酸）混合物。Sm表示糖（核糖和d-甘露糖）混合物。向上箭头表示上调。向下箭头表示下调。